Bài 1: Giá thể sau nuôi cấy mô

Đại học Sư Phạm Hà Nội
Khoa Sinh học
Tiểu Luận:
Kỹ thuật chăm sóc cây nuôi cấy mô giai đoạn sau ống nghiệm và các giá thể thường được sử dụng





Sinh viên: Lê Thanh Hiệp
Hoàng Văn Hào
Giảng viên: Th.s Đào Thị Lý
Phần I: Giới thiệu chung
1.1. Nuôi cấy mô tế bào thực vật:
1.1.1. Giới thiệu chung:
* Định nghĩa:
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật trong môi trường dinh dưỡng nhân tạo, ở điều kiện vô trùng. Môi trường có các chất dinh đuỡng thích hợp như muối khoáng, đường, vitamin và các hoocmon sinh trưởng.
Công nghệ nuôi cấy mô cây gỗ nghiến (lõi thọ)
Phân hoá tế bào
Tế bào
phôi sinh
Tế bào dãn
Tế bào
chuyên hoá
Phản phân hoá tế bào
Cơ sở khoa học
1.1.2. Ý nghĩa của công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật:

Mở ra khả năng to lớn cho việc tìm hiểu sâu sắc bản chất của sự sống.

Nhân nhanh tế bào và nuôi cấy tế bào sinh đuỡng thành phôi trong điều kiện in vitro.

Cở sơ cho nền công nghiệp sản xuất các sản phẩm sinh học có nhiều ứng dụng trong cuộc sông: thuốc chữa bênh, chất kháng sinh…

Tế bào có tính toàn năng do lưu trữ và biến đổi được thông tin di truyền. Vì vậy, nuôi cấy mô thực vật có ý nghĩa lớn trong công nghệ chuyển gen.

- Là cơ sở của công nghệ đơn bội và tạo giống tam bội không hạt từ nội nhũ.
2. Lịch sử và thành tựu đạt được trong nuôi cấy mô:
2.1. Trên thế giới:
Mô động vật được cấy trước tiên, do A Carrel (1919), đến năm 1934 mô thực vật mới được cấy.
Năm 1951, Skoog và Miller đã phát hiện ra các hợp chất có thể điều khiển sự nhân chồi.
Năm 1964, Ball là người đầu tiên tìm ra mầm rễ từ việc nuôi cấy chồi ngọn.
Năm 1962, Murathige và Skoog đã cải tiến môi trường nuôi cấy đánh dấu một bước tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô. Môi trường của họ dùng làm cơ sở cho việc nuôi cấy nhiều loại cây và vẫn còn được sử dụng rộng rãi cho đến nay.
2.2. Ở Việt Nam:
Sau 1975, phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào đầu tiên được xây dựng tại viện Sinh vật học, viện Khoa học Việt Nam do tiến sĩ Lê Thị Muội đứng đầu.
Hiện nay, các hướng nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy mô và tế bào thực vật được phát triển mạnh: dung hợp cây lai tế bào chất và chuyển gen, Nuôi cấy bao phấn để tạo dòng thuần, Nuôi cấy các cây dược liệu quý để bảo tồn nguồn gen và tạo các dòng tế bào có hàm lượng các chất sinh học
3. Quy trình vi nhân giống:
Giai đoạn 1: Giai đoạn chuẩn bị
Mục đích là tạo ra nguồn nguyên liệu thực vật vô trùng đưa vào nuôi cấy in vitro.
Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy

Mục đích là tái sinh có định hướng các mô nuôi cấy. Tỉ lệ hợp chất auxin/xitokitin ngoại được đưa vào môi trường nuôi cấy là yếu tố điều khiển quá trình này.
Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi
Quá trình nhân giống in vitro là quá trình tạo ra hệ số nhân chồi cao nhất. Để tăng hệ số nhân giống thì môi trường nuôi cấy phải được đưa thêm các chất điều hào sinh trưởng: auxin, xitokinin, gibberelin… các chất bổ sung khác như nước dừa, nước chiết nấm men… kết hợp các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng phù hợp
Giai đoạn 4: Tạo rễ
Khi đạt đến kích thước nhất định, các chồi được chuyển sang giai đoạn tạo rễ, môi trường tạo rễ thường được bổ sung một lượng nhỏ auxin.
Giai đoạn 5: Đưa cây ra vườn ươm.
Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỉ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo:
+ Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây).
+ Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp
A. Mô sẹo từ Catharanthus roseus. (B)Nuôi cấy dịch tế bào từ Coryphanta spp. (C) Nốt sần C. roseus. (D) Đầu rễ từ C. roseus. (E)Tái sinh cây từ C. roseus callus. (F) Protoplasts từ Coffea arabica (G) Vi nhân giống của Agave tequilana. (H) Phôi vô tính của cây Coffea canephora. (I) Nuôi cấy rễ cây Psacalium decompositum.
4. Các phương thức vi nhân giống:
4.1. Hoạt hoá chồi nách:
Theo phương thức này sự phát triển của chồi diễn ra theo 2 cách:
- Cây phát triển trực tiếp từ chồi đỉnh hoặc chồi nách (cây 2 lá mầm).
- Tạo cụm chồi từ chồi đỉnh hoặc chồi nách (cây 1 lá mầm).
4.2. Tạo chồi bất định:
Trong trường hợp này thường sử dụng các bộ phận của cây như thân , mảnh lá, cuống hoa, dẻ hành…Trong trường hợp này cần phải thực hiện quá trình phản phân hoá và tái phân hoá các tế bào để các tế bào soma hình thành chồi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn mô sẹo.
Chỉ sử dụng các mô sẹo vừa hình thành để tái sinh thành cây, bởi mô sẹo qua nhiều lần cấy chuyển sẽ dễ tạo biến dị.

4.3. Tạo phôi vô tính.
Tạo phôi vô tính A. Phôi nuôi cấy; B, C. Mô sẹo và mô sẹo phôi hoá tạo thành từ phôi non; D. Cây tái sinh; E, F, G. Mô sẹo tạo thành từ phôi nuôi cấy có kích thước 0,5; 1-2 và 3 mm tương ứng;
PHẦN 2: ĐIỀU KIỆN TRỒNG CÂY SAU NUÔI CẤY
1. Trồng cây dưới mái kính:
1.1. Nhà kính:




1.2. Tạo môi trường thích hợp:
1.3. Sưởi ấm:
Hệ thống sưởi ấm nên đủ lớn để cho nhà kính ở nhiệt độ tối thiểu. Nếu điệu kiện không cho phép ta có thể dán kín nhà kính vào mùa đông.
1.4. Thông gió:
Vào đầu mùa xuân phải mở quạt thông gió để tránh nhiệt độ tăng đột ngột.
Khi mùa xuân sắp sang hạ, ta có thể chắc chắn hơn là nhiệt độ sẽ không sụt và có thể mở quạt thông gió suốt ngày, dần dần tăng thời gian quạt hoạt động, cho đến giữa mùa hạ thì có thể mở quạt thường xuyên ngày và đêm.
Một khi ban đêm trời lạnh thì cần phải đóng các quạt thông gió và giữ ấm cho cây. Suốt những tháng mùa đông, vào những ngày nắng nhièu hay thậm chí là u ám, khi gió thông thổi nhiều thì có thể mở quạt trong những thời gian ngắn để làm cho không khí mát lên và giúp giảm bớt không khí đặc.

1.6. Làm ẩm và tưới cây:
Làm ẩm là việc phải làm hàng ngày suốt trong năm.
Vào mùa hạ đến giữa trưa độ ẩm này sẽ bốc hơi và phải xịt cho ẩm trở lại. Suốt những lúc mưa nhiều vào mùa đông thì có thể không phải làm ẩm hoàn toàn.
Tốt nhất nên có hệ thống xịt nước tự động trên mái và ở phía bên các giàn cây. Vừa có thể giữ được độ ảm mà cũng thực hiện luôn phần tưới cây cho người chăm sóc.
Máy phun hơi ẩm
2. Trồng cây ngoài trời:
Đối với những nơi không có điều kiện xây nhà kính buộc phải trồng cây ngoài điều kiện thường thì việc đảm bào tất các yếu tố: nhiệt, ẩm, ánh sáng… Càng cần được quan tâm hơn.
Với mỗi loại cây thì có những chế độ chăm sóc khác nhau

Giống cây bạch đàn cấy mô
Lan cấy mô
PHẦN 3: GIÁ THỂ TRỒNG CÂY SAU NUÔI CẤY
1.1.Giới thiệu chung:
Giá thể có thể hiểu đơn giản là loại môi trường sinh học nhân tạo được sử dụng trong kỹ thuật giâm cành hay ra cây sau nuôi cấy trong phòng thí nghiệm.
Giá thể lý tưởng phải có những đặc điểm:
- Có khả năng giữ ẩm cũng tốt như độ thoáng khí.
- Có pH trung tính và có khả năng ổn định
- Thấm nước dễ dàng.
- Bền, có khả năng tái sử dụng hoặc phân hủy an toàn cho môi trường.
- Nhẹ, rẻ và thông dụng.
Ngày nay giá thể đã khác nhiều so với hồi còn dùng sỏi và cát.
1.2. Các loại giá thể thường dùng:
Người ta có thể trồng bằng nhiều thứ nư vỏ cây, đá, sỏi, cát, sơ dừa, rêu… Nhưng mỗi chất liệu có những đặc tính khác nhau cho nên có những lợi điểm và khuyết điểm. Chúng ta nên nhớ rằng mỗi loại cây cần một chất liệu trồng khác nhau và mỗi chất liệu lại cần một cách tưới bón thích hợp.
1.2.1. Vỏ thông (Fir Bark):
Thứ này thông dụng cho trồng lan hơn cả, rẻ tiền, dễ mua, giữ nước và độ ẩm. Điều bất tiện là thứ này giữ chất muối có sẵn trong nước và trong phân bón, chỉ giữ được chừng 2/3 số Nitơ trong phân bón và thông thường sẽ bị mục nát trong khoảng 2-3 năm. Có 3 hạng:Lớn, Vừa, Nhỏ
1.2.2. Gỗ thông đỏ (Red wood shaving):
Thứ này cũng không quá đắt, giữ nhiều nước và độ ẩm, lại nhiều axit cho nên chỉ dùng dưới 50%, trừ được nấm men trắng. Sên không vỏ không ưa thứ này. Điều bất tiện là thứ này trồng không chặt cho nên phải cột cây vào chậu và khó tìm loại gỗ tốt.
1.2.3.Rễ cây dương xỉ (Tree fern):
Thứ này mau khô, lâu bền, được trên 3 năm mới mục.
1.2.4. Sơ dừa, vỏ dừa (Coconut fiber, chip):
Khuyết điểm sơ dừa là mau khô và nhẹ cho nên không giữ cây thẳng đứng được.
Vỏ dừa cắt nhỏ có 2 loại vừa và nhỏ. ưu điểm là ngấm nước mau hơn và giữ độ ẩm lâu hơn. Nhưng phần đông các loại sơ dừa đều có nhiều muối ở trong nên cần phải ngâm nước vài ngày, xả cho sạch rồi mới trồng được.
1.2.5. Than (Charcoal):
Thường áp dung cho lan. Than trồng lan không phải là thứ than đốt lò đã làm sẵn từng viên. Than phải đốt từ củi dùng cho việc trồng trọt. Than có ưu điểm lâu bền từ 5 – 6 năm mới phải thay chậu và chỉ dùng một cỡ cho dù thứ cây lớn nhỏ. Sên không vỏ không ưa sống trong than. Nhược điểm là quá đắt và giữ chất muối và phân bón cho nên cứ 2 tháng phỉa xả thật nhiều nước cho sạch.
1.2.6. Đá núi lửa (Lava Rock):
Đá núi lửa có ưu điểm dễ ngâm nước, không bị mục, thoáng hơi và không quá nặng. Rất tốt để lót đáy chậu thay cho chất xốp đậu phộng. Nhượng điểm quá đắt là giữ chất muối cho nên cứ 2 tháng phải xả nước cho sạch. Sên không vỏ ưa trú ngụ trong kẽ đá.
1.2.7. Đá xốp ( Pumice rock)

Đá pumice là một loại lava rock nhưng nhẹ hơn và thấm nước, lâu bền không bị mục nhưng cũng có nhược điểm là giữ muối vì thế có nhiều loại lan không ưa loại đá này.
1.2.8. Đá bọt (Perlite or sponge rock)

Đá bọt rất nhẹ và thấm nước, dùng để trộn với vỏ thông hoặc rễ cây để cho thoáng khí rất thích hợp cho các loại lan có rễ nhỏ.
1.2.9. Dớn trắng (Sphagnum moss):
Dớn trắng rất có giá trị vì chúng có cấu trúc dạng sợi, rất dài, dù ở dạng khô hay tươi. Các sợi dớn dù khô hay tươi cũng rất bền, chắc, khó bị phân huỷ nên khi sử dụng rất ít bị thay chất trồng như các chất trồng khác
    Dớn có khả năng giữ nước rất lớn gấp 20 lần trọng lượng khô của chúng.
   Dớn trắng có khả năng hấp thu nước và thải ra các cation H+     
Dớn trắng có khả năng trao đổi cation rất lớn,
    Dớn trắng còn có một số thành phần kháng khuẩn tự nhiên giúp ức chế sự tăng trưởng của một số nấm.
1.2.10. Cát (Sand):
Một số loại cây nuôi cấy mô như: huệ, cúc, mía, đồng tiền… vẫn được trồng trên loại giá thể rẻ tiền này. Cát phải được rửa sạch luôn được tưới ẩm. Có ưu điểm là thoáng khí nhưng nghèo chất dinh dưỡng và nhanh bị khô.
1.2.11. Xơ mướp: Áp dụng trồng lan
Xơ mướp rẻ bán ở các chợ dễ mua lai rẻ, mua về ngâm nước 1-2 ngày cho mềm bỏ vảo chậu khoãng 2 miếng tùy chậu không nên nén chặt. Bên dưới rải 1 lớp than đã ngâm kỹ cho hết bụi than , cố định cây lan chặt (nên chọn lan đang ra rể 2cm ) để tưới nước không hư rể, tưới phân bình thường. Nhược điểm của loại giá thể này là thời gian tồn tại ngắn, dễ bị mốc và côn trùng xâm hại.
1.3. Một số nghiên cứu giá thể mới hiện nay:
1.3.1. "Green Land" thành phần gồm:
Chỉ xơ dừa, bụi mụn dừa, phân hữu cơ giải chậm, được xử lý tiệt trùng và nén lại thành thỏi 2cm x 2cm, bánh tròn đường kính 5cm, hoặc vuông 5cm.
Green Land có 03 loại dùng riêng biệt cho: Phong lan, hoa và cây thân thảo, và cây thân mộc với thành phần dinh dưỡng phù hợp cho từng loại cây trồng.
1.3.2. Than gáo dừa:
Được xay nhuyễn và nén chặt thành viên tròn nhỏ 2cm.
Hai loại này dùng để trồng lan và có thể thay thế cho các nguyên liệu hiện đang sử dụng trên thị trường.
1.3.3. Giá thể trồng lan từ phụ phế phẩm nông nghiệp
Nhóm nghiên cứu tại Viện Nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt đã sử dụng các loại phụ phế phẩm như bã mía, lõi ngô, vỏ đậu phộng, vỏ cà phê… đều có thể tận dụng trong sản xuất phân hữu cơ nhờ các chủng vi sinh ưa nhiệt, có khả năng phân giải các phụ phế phẩm này thành giá thể để trồng hoa, không chỉ địa lan mà còn áp dụng cho nhiều loài hoa và cây cảnh khác nhau, thay thế cho các giá thể truyền thống.
PHẦN 4: KẾT LUẬN
Bước đầu chúng tôi đã tìm hiểu được những điều kiện cần thiết chăm sóc cây sau nuôi cấy như: ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, chế độ nước…cùng một số giá thể thường dùng cho các loại cây: lan, mía, rau xanh…
Nghiên cứu kỹ thuật chăm sóc và giá thể trong công nghệ nuôi cấy mô luôn là vấn đề phải được ưu tiên và cần đựoc quan tâm nhiều hơn.