32trtukkkl.l

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG HÀN GẮN GÃY XƯƠNG BẰNG LIỆU PHÁP CẤY GHÉP
TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ NGƯỜI (hMSC)
TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT NHẮT TRẮNG
(Mus musculus var. Albino)
HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. DƯƠNG THỊ BẠCH TUYẾT
ThS. PHẠM VĂN PHÚC



BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA SINH HỌC
BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỖ THÀNH TRÍ
NỘI DUNG BÁO CÁO
Đặt vấn đề
Tổng quan
Nội dung nghiên cứu
Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu
Kết quả - Biện luận
Kết luận – Kiến nghị
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Mỗi năm ở Mỹ có khoảng 2 triệu trường hợp gãy xương dài được xác nhận và khoảng 100.000 (5%) trường hợp là gãy xương không có khả năng tự hàn gắn.
Ở Việt Nam, số vụ tai nạn giao thông ngày càng tăng. Theo thống kê của bệnh viện Chợ Rẫy, trong 4 tháng đầu năm 2009, bệnh viện đã tiếp nhận 5.274 bệnh nhân tai nạn giao thông, trong đó có nhiều trường hợp gãy xương không có khả năng tự phục hồi gây tử vong hay tàn tật suốt đời.
II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
II.1. Gãy xương
Gãy xương là một tình trạng mất tính liên tục của xương.
Gãy xương kín: độ 0, I, II, III.
Gãy xương hở: độ I, II, III, IV.
Gãy xương không tự hàn gắn:
Người: sau 6-8 tháng
Chuột: sau 28 ngày
II.2. Tế bào gốc trung mô (MSC)
Các tế bào gốc đa năng, có thể biệt hóa thành nhiều loại tế bào như tế bào xương, sụn, cơ, mỡ, thần kinh…
Không gây đáp ứng miễn dịch khi dị ghép: do không biểu hiện B7-1, B7-2, CD-40
II.3. Những nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc trong hàn gắn xương trên mô hình động vật.
Chú thích: ADSC=adipose-derived stem cell (tế bào gốc mỡ),
BMDSC=bone marrow-derived stem cell (tế bào gốc tủy xương)
III. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Thiết kế mô hình sử dụng lực gây ra bởi vật nặng rơi tự do để tạo chuột gãy xương chân sau (xương cẳng chân).

Khảo sát khả năng giúp hàn gắn xương bằng liệu pháp ghép hMSC ở các liều tế bào khác nhau trên mô hình chuột gãy xương.
IV. ĐỐI TƯỢNG- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Hình 1. Mẫu vật dùng trong đề tài
a). Chuột nhắt trắng cái 5 tuần tuổi
b). Tế bào gốc trung mô máu cuống rốn người (hMSC)
IV.1. Đối tượng nghiên cứu
a
b
IV.2. Phương pháp nghiên cứu
IV.2.1.Tạo mô hình chuột gãy xương cẳng chân sau gây ra bởi vật nặng rơi tự do
Hệ thống dụng cụ tạo mô hình chuột gãy xương
Gây mê cho chuột - tiêm ketamine
Cho vật nặng rơi tự do
Hình 2. Thao tác tạo mô hình chuột gãy xương chân sau
Lực khảo sát tương ứng với chiều cao treo vật nặng
Quy trình tạo mô hình chuột gãy xương chân sau
Chuột 5 tuần tuổi
Gây mê bằng 0,1ml ketamine/con
Buột bàn chân trái của chuột bằng chỉ
Đặt chuột lên mặt phẳng
Che các phần cơ thể (trừ chân trái) bằng xốp
Cố định vị trí cần gây gãy xương
Cho vật nặng (100g) rơi tự do với chiều cao tương ứng với lực đã tính
Mô hình chuột gãy xương chân sau
IV.2.2. Thu nhận tế bào đã được tăng sinh in vitro
Mẫu tế bào nuôi (70 % - 80%)
Đổ bỏ môi trường cũ
Rửa bằng 3ml PBS/KS
Bổ sung 1ml Trypsin/EDTA 0,25%
3-5 phút
Huyền phù hMSC, chuyển 1 ml vào eppendorf
Đổ bỏ dịch nổi, thêm 1 ml môi trường nuôi , tái huyền phù
Ly tâm 3000 vòng/phút , 5 phút
Đổ bỏ môi trường, thêm PBS chỉnh về 106 tế bào/ml; 107 tế bào/ml; 108 tế bào/ml
Xác định tế bào sống trong 1 ml huyền phù thu được
Ly tâm 3000 vòng/phút , 5 phút
Quy trình thu nhận tế bào đã được tăng sinh in vitro
IV.2.3. Định lượng tế bào sống bằng phương pháp nhuộm đếm với trypan blue
Mục đích: xác định số tế bào sống trong huyền phù hMSC
Trypan blue là thuốc nhuộm màu xanh dương chỉ có thể xuyên qua màng tế bào chết.
10 μl huyền phù tế bào + 10 μl trypan blue 0,4%
Trộn đều rồi hút hỗn hợp này cho từ từ vào buồng đếm.
Đếm số tế bào sống (không bắt màu trypan blue) trong 5 ô lớn (đếm 3 lần lặp lại)
Mật độ tế bào Ai = 2(a x 5) x 104 (số tế bào /ml)
Trong đó:
a: Số tế bào đếm được trong 5 ô lớn
2: Tỉ lệ pha loãng 2 lần khi nhuộm trypan blue
104: Hệ số thể tích
Hình 3. Buồng đếm hồng cầu
A1 +A2 +A3
3
A = Ai =
(tế bào/ml)
IV.2.4. Cấy ghép hMSC vào mô hình chuột gãy xương
Sát trùng vị trí tiêm trên chân chuột bằng cồn.
Tiêm 0,1ml huyền phù hMSC chứa 105 tế bào/con, 106 tế bào/con, 107 tế bào/con vào vị trí gãy xương.
IV.2.5.Phương pháp đánh giá kết quả
IV.2.5.1. Khảo sát khả năng điều khiển chân sau trái khi di chuyển trên mặt bàn và bơi trong nước

Nguyên tắc: Xem xét sự điều khiển hoạt động của chân bị gãy khi vận động (đi trên mặt bàn và bơi trong nước) và được phân thành 3 mức độ:
Không điều khiển được chân (-)
Điều khiển chân kém (+/-)
Điều khiển chân tốt (+)
Không điều khiển được chân (-)
Điều khiển chân tốt (+)
Điều khiển chân kém (+/-)
Hình 5. Sự di chuyển với các mức độ khác nhau của mô hình chuột
A. Di chuyển trên mặt bàn; B. Bơi trong nước
A
B
a. Giết chuột bằng cách kéo dãn cột sống
b. Thu chân gãy của chuột
c. Lóc hết phần cơ bao xung quanh xương chân chuột
d. Xương chân chuột
IV.2.5.2. Thu xương chân sau trái – Đánh giá hình thái giải phẫu xương
a
b
c
d
Hình 6. Quy trình thu xương chân chuột
QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU TỔNG QUÁT
Thiết kế mô hình sử dụng lực gây ra bởi vật nặng 100g rơi tự do
Gây mê chuột bằng ketamine và tạo mô hình chuột gãy xương cẳng chân sau trái
Mô hình chuột gãy xương chậm hàn gắn hoăc không hàn gắn
hMSC thu nhận từ máu cuống rốn người
Khả năng giúp hàn gắn xương trên chuột của hMSC và liều ghép hMSC để giúp hàn gắn xương tốt nhất
Ghép hMSC
1N
2N
3N
4N
5N
Nuôi cấy tăng sinh in vitro
Thu huyền phù hMSC
105tế bào/con
106tế bào/con
107tế bào/con
ĐC: không ghép
V. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN
V.1. Kết quả nghiên cứu tạo mô hình chuột gãy xương chân sau

V.2. Kết quả khảo sát khả năng hàn gắn xương bằng cấy ghép hMSC vào mô hình chuột gãy xương chân sau

V.1. Kết quả nghiên cứu tạo mô hình chuột gãy xương cẳng chân sau

V.1.1. Đánh giá cảm quan ngay sau tạo mô hình
Bảng 1. Phân loại mức độ gãy xương chân sau trái theo các lực tác dụng
V.1.2. Kết quả khảo sát khả năng điều khiển chân sau trái
a. Sau 7 ngày tạo mô hình
Chú thích chung:
(+): Điều khiển tốt
(+/-): Điều khiển kém
(-): Không có khả năng điều khiển
(x): Hoại tử
Bảng 2. Kết quả khảo sát mô hình chuột sau 7 ngày
Hình 7. Biểu đồ kết quả khảo sát mô hình chuột sau 7 ngày
Nhận xét:
- Lô 1, 2: 100% các mẫu đều điều khiển được chân sau trái.
- Lô 3: 100% các mẫu với chân trái không có khả năng điều khiển được.
- Lô 4: có một trường hợp bị hoại tử, các trường hợp còn lại không điều khiển được chân sau trái khi di chuyển.
- Lô 5: 100% các mẫu với phần chân trái ở đoạn dưới vị trí gãy bị hoại tử (không xét ở các tuần tiếp theo)
b. Sau 14 ngày tạo mô hình
Hình 8. Biểu đồ kết quả khảo sát mô hình chuột sau 14 ngày
Bảng 3. Kết quả khảo sát mô hình chuột sau 14 ngày
c. Sau 21 ngày tạo mô hình
Hình 9. Biểu đồ kết quả khảo sát mô hình chuột sau 21 ngày
Bảng 4. Kết quả khảo sát mô hình chuột sau 21 ngày
d. Sau 28 ngày tạo mô hình
Hình 9. Biểu đồ kết quả khảo sát mô hình chuột sau 28 ngày
Bảng 4. Kết quả khảo sát mô hình chuột sau 28 ngày
Đánh giá chung
TUẦN
Hình 10. Biểu đồ thể hiện khả năng điều khiển tốt chân sau của chuột theo thời gian
Số lượng chuột điều khiển chân tốt
V.1.3. Hình thái giải phẫu xương và sự tự hàn gắn xương theo thời gian
a
e
c
d
Hình 11. Hình thái xương chi chuột sau giải phẫu
a. Lô 1 – 1N; b. Lô 2 – 2N;
c. Lô 3 – 3N; d. Lô 4 – 4N; e. Lô 5 – 5N
b
So sánh hiệu quả tạo mô hình gãy xương cẳng chân của lực 3N và 4N, ta thấy rằng việc tạo mô hình với lực 4N hiệu quả hơn vì:
Tuy có một trường hợp bị hoại tử nhưng tỉ lệ thấp. Đó là điều không thể tránh khỏi khi tạo mô hình gãy xương mà thời gian tự hàn gắn k